НОВЫЕ БЛОКАТОРЫ ИОННЫХ КАНАЛОВ ИЗ ЯДОВ ЗМЕЙ – ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
Список сокращений
АД – артериальное давление
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография мАХР – мускариновый ацетилхолиновый рецептор
НТ – нейротоксин
ТФУ – трифторуксусная кислота ФЛА2 – фосфолипаза А2
нАХР – никотиновый ацетилхолиновый рецептор
АХСБ – ацетилхолин-связывающий белок
μl – микролитр
μM – микромоль в литре
Содержание
Введение
1. Состояние химии змеиных ядов
1.1 Получение ядов и их физико-химические свойства
1.2 Семейства белков ядов змей
1.3 Структура и свойства основных белков змеиных ядов
1.4 Фосфолипазы А2 и их классификация
1.5 Фосфолипазы А2 ядов змей
1.6 Трехпетельные токсины
1.7 α-Нейротоксины
2. Нестандартные токсины
3. Димерные токсины
3.1 Димер α-кобратоксина
3.2 κ-бунгаротоксин
3.3 Ирдитоксин
3.4 Хадитоксин
3.5 CRISP ядов змей – блокаторы ионных каналов
3.6 Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца
4. Материалы и методы
4.1 Объект исследования
4.2 Выделение целевых соединений
4.2.1 Разделение яда Bitis arietans
4.2.2 Разделение яда Bungarus multicinctus
4.3 Исследование функциональной активности
4.3.1 Исследование активности фракций Bitis arietans
4.3.2 Исследование активности фракций Bungarus multicinctus
5. Результаты и обсуждение
5.1 Исследование активности компонентов яда Bitis arietans
5.2 Исследование активности компонентов яда Bungarus multicinctus
Выводы
Список литературы
Введение
В процессе эволюции в пищеварительной системе змей выработались специальные приспособления для проглатывания крупной добычи, и сформировался ядовитый аппарат, обеспечивающий ее обездвиживание.
Змеиные яды — сложный комплекс биологически активных соединений: ферментов (главным образом гидролаз), токсических полипептидов, ряда белков со специфическими биологическими свойствами (фактор роста нервов — ФРН, антикомплементарные факторы), а также неорганических компонентов. Многие ферменты являются общими для ядов змей различных семейств, например фосфолипаза А2, гиалуронидаза, оксидаза L -аминокислот, фосфодиэстераза, 51-нуклеотидаза и другие, что отражает тесную филогенетическую связь ядовитых желез с экзокринными железами пищеварительного тракта.
В то же время существуют и отличия, характеризующие яд змей той или иной систематической группы. Так, в состав яда семейств Elapidae и морских змей Hydrоphidae входят токсические полипептиды (нейротоксины), нарушающие передачу возбуждения в нервно-мышечных синапсах и тем самым вызывающие вялый паралич скелетной и дыхательной мускулатуры. Смерть отравленных животных и человека наступает, как правило, от остановки дыхания. В этих ядах присутствует также фермент ацетилхолинэстераза, разрушающий ацетилхолин и усугубляющий развитие паралича.
Поиск белков с новыми фармакологическими свойствами, которые могут использоваться в качестве инструментов для фундаментальных исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также служить основой для создания новых лекарственных препаратов, является актуальной проблемой современной биоорганической химии. Яды змей исследуются уже давно, и к настоящему моменту большинство из них достаточно хорошо изучено. Наиболее вероятно, что соединения с новыми свойствами могут быть обнаружены либо среди мало представленных в ядах соединениях, либо в малоизученных или вовсе не изученных ядах. Следует также отметить, что в последнее время с применением методов генной инженерии идентифицировано большое количество белков, представляющих собой новые типы и подтипы рецепторов и ионных каналов. Однако их функциональная характеристика затруднена отсутствием специфических лигандов. Яды змей служили и продолжают служить источником селективных лигандов и рецепторов ионных каналов.
Целью настоящей работы явился поиск в ядах змей и характеристика новых пептидов и белков, являющихся ингибиторами лиганд- и потенциал- управляемых ионных каналов.
Задачи работы:
Разработать условия хроматографического разделения ядов для выделения активных соединений и осуществить скрининг полученных фракций для обнаружения активных соединений.
Выделить из ядов активные соединения белковой и пептидной природы в количествах, достаточных для проведения биологических тестов, и установить их аминокислотные последовательности.
Проанализировать биологическую активность выделенных белков и синтетических пептидов in vitrо.
яд белковый пептидный хроматографический
1. Состояние химии змеиных ядов
1.1 Получение ядов и их физико-химические свойства
Наиболее простым способом получения ядовитого секрета у змей является механический массаж ядовитых желез. Сейчас часто вместо механического массажа применяют стимуляцию электрическим током.
Электростимуляция не только является более щадящим методом сбора яда, но и позволяет получать большее его количество. Количество яда, получаемого от одной особи, зависит от размеров тела змеи, ее физиологического состояния, числа повторных взятий яда, а также от ряда условий внешней среды.
Необходимо отметить, что содержание змей в неволе отражается не только на количестве получаемого яда, но и на его токсичности. Так, у яда кобры понижение токсичности наблюдается уже после полугода содержания в неволе. Яд гюрзы изменяет токсичность только после 2 лет содержания в питомнике. Что касается мелких змей (гадюка, щитомордник, эфа), то содержание их в серпентариях в течение года не отражается на свойствах ядов [Орлов,1987].
Свежедобытый змеиный яд представляет собой слегка опалесцирующую, вязкую, достаточно прозрачную жидкость, цвет которой варьирует от светло-желтого до лимонного [Дунаев, Кауров, 2010].
Активная реакция ядов обычно кислая. Водные растворы их нестойки и теряют токсичность через несколько суток. Гораздо более устойчивыми к воздействию факторов внешней среды они становятся после высушивания над хлористым кальцием или лиофилизации. Яды довольно термостабильны и в кислой среде выдерживают нагревание до 120 градусов Цельсия без потери активности. Разрушающе действуют на яды химические реагенты: КМnО4, эфир, хлороформ, этанол, метиленовый синий. Так же воздействуют физические факторы: УФ-облучение, рентгеновские лучи.
1.2 Семейства белков ядов змей
Достижения и успехи в области изучения химического состава ядов тесно связаны с развитием и совершенствованием методов фракционирования и очистки сложных смесей высокомолекулярных соединений.
Вопросы о химической природе и механизмах действия змеиных ядов привлекали внимание исследователей. В ранних работах токсическое действие связывали с активностью присутствующих в ядах ферментов. В настоящее время согласно общепринятой точке зрения, наряду с содержащимися в ядах мощными ферментными системами токсические свойства определяются также неэнзиматическими полипептидами. От природы и специфичности действия этих систем в большинстве случаев зависит своеобразие интегральной картины отравления.
Если же рассматривать не число пептидов и белков, а их весовое содержание в яде, то в наибольшем количестве содержатся соединения, относящиеся к трем-четырем структурным мотивам. Несомненное первенство здесь принадлежит фосфолипазам А2 (ФЛА2). Пожалуй, к настоящему времени не известно ни одного змеиного яда, в котором не было бы ФЛА2. Из белков, не обладающих ферментативной активностью, самыми представленными являются так называемые трех-петельные токсины (ТПТ). Английский вариант названия – three-finger tоxins. Это название они получили вследствие оригинальной укладки полипептидной цепи. Молекула токсина имеет компактное гидрофобное ядро, стабилизированное четырьмя дисульфидными связями. Из этого ядра выступают три полипептидных петли, напоминающие три вытянутых пальца, что собственно и дало англоязычный вариант названия. ТПТ обладают широким набором биологической активности, начиная от неспецифического лизиса клеточных мембран (так называемые цитотоксины) и заканчивая высоко специфическим взаимодействием с определенными типами нейрорецепторов (так называемые α-нейротоксины).
1.3 Структура и свойства основных белков змеиных ядов
Яды змей представляют собой сложную смесь энзиматически активных белков и полипептидных токсинов. Весь этот богатый арсенал средств предназначен для воздействия, зачастую с большой селективностью и высокой степенью взаимодействия между собой, на различные молекулярные структуры, принимающие участие в важнейших физиологических процессах.
Секреция яда является настолько характерной особенностью многих высших змей (Cenоphidia), что его состав может служить таксономическим и филогенетическим признаком [Fry et al., 2003; Fry, 2005; Fry et al, 2006; Slоwinsky and Keоgh, 2000]. Низшие (Henоphidia) и червеобразные (Scоlecоphidia) змеи не ядовиты. По своему действию яды змей делят на нейротоксические и гемотоксические [Tu, 1977]. К первой группе относятся яды родственных семейств Elapidae и Hydrоphiidae. Укусы представителями этих семейств приводят к поражению нервной системы жертвы, что выражается обычно в паралитических явлениях и других нейропатиях. Отравление ядами второй группы, к которым относят яды Viperidae и Crоtalidae (последних иногда включают в Viperidae в ранге подсемейства), характеризуются отеками в месте укуса, геморрагиями, кровоизлиянием в органы и падением кровяного давления вследствие обильной внутренней кровопотери. Яды Cоlubridae (не все представители этого семейства я
