Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы

Модификация белков убиквитином, приводящая к направленной деградации внутриклеточных белков 26S протеасомой, является одним из фундаментальных клеточных процессов. На настоящий

Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы

Курсовой проект

Биология

Другие курсовые по предмету

Биология

Сдать работу со 100% гаранией

Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы

Содержание

Введение

1. Протеасомо-опосредованный гидролиз белков и методы его мониторинга

1.1 Протеосома

1.1.1 Строение и функции протеасомы

1.2 Убиквитин

1.2.1 Модификации убиквитином

1.2.2 Узнавание убиквитина

1.2.3 Убиквитин-зависимый путь деградации белков

1.3 Система убиквитирования/деубиквитирования

1.4 Современные методы исследования белков

1.5 LplA лигаза

1.6 Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli

1.7 Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях

2. Материалы и методыисследования

2.1 Материалы исследования

2.2Методы исследования

2.3 Работа с нуклеиновыми кислотами

2.4 Методы работы с бактериями Escherichia coli

2.5 Методы работы с эукариотическими клетками HEK

2.6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

3. Результаты и обсуждение

Выводы

Список литературы

Введение

белок гидролиз бактерия кислота

Модификация белков убиквитином, приводящая к направленной деградации внутриклеточных белков 26S протеасомой, является одним из фундаментальных клеточных процессов. На настоящий момент считается, что как минимум половина белков в клетке разрушается при участии системы убиквитинилирования, насчитывающей, в свою очередь, более тысячи индивидуальных представителей в составе клеточного протеома.

Несмотря на множество методик, предложенных для наблюдения протеасомо-опосредованного гидролиза белков, подавляющее большинство из них подразумевает добавление специфических веществ, останавливающих белковый синтез, и последующее необратимое разрушение клеток. Добавление к исследуемым белкам высокомолекулярных ДНК-кодируемых флуорофоров приводит к значительным изменениям субстратных свойств изучаемых мишеней, что также значительно ограничивает подобную методику. В настоящей работе нами предложен альтернативный подход к решению описанной задачи с использованием липоат-лигазы типа А (LplA).

Объект – убиквитин-протеасомная система.

Предмет – клеточный метаболизм протеасом-зависимых и независимых белков, а также важнейшего представителя убиквитин-протеасомной системы – убиквитина.

Цель исследования – анализ внутриклеточного протеасом- опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы.

Задачи исследования:

          Теоретический анализ литературы отечественных и зарубежных авторов по теме исследования.

          Создание генетических конструкций, кодирующих в составе полицистронной кассеты белковые субстраты и мутантную липоат-лигазу LplA, совмещенную с репортерным белком ZsGreen1.

          Отработка оптимальных условий внутриклеточной конъюгации белков- мишеней с резоруфином, катализируемое LplA.

          Изучение внутриклеточного метаболизма ряда белков и убиквитина с применением разработанной методики.

Для решения поставленных задач и проверки исходных положений была определена методологическая база и методы исследования: методы теоретического анализа; эксперимент; методы генетической инженерии; электрофоретическое разделение белков в полиакриламидных гелях; измерение флуоресценции; блоттинг по Вестерну; прижизненная флуоресцентная микроскопия; методы компьютерной математической обработки полученных данных с построением графиков (SigmaPlot 11.0).

Теоретическая значимость:

    рассмотрены имеющиеся данные о убиквитин-протеасомной системе;

− проанализированы результаты научно-исследовательских публикаций по изучению методов анализа внутриклеточной деградации белков;

    описана методологическая основа специфического внутриклеточного мечения белков низкомолекулярными флуорофорами;

    обозначены молекулярно-биологические аспекты исследуемой проблемы.

Практическая значимость:

    получены данные по времени полужизни важного аутоантигена при рассеянном склерозе основного белка миелина (МВР), уточнены параметры метаболизма одной из главных мишеней при терапии онкологических заболеваний дегидрофолатредуктазы (DHFR), а также главного элемента протеасомной системы деградации белков – убиквитина – в истинно физиологических условиях.

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) в Лаборатории биокатализа (Отдел пептидно-белковых технологий).

Автор выражает благодарность коллективу Лаборатории биокатализа ИБХ РАН, заведующему лабораторией чл.-корр. РАН, д.х.н., проф. Габибову Александру Габибовичу, старшему научному сотруднику к.х.н. Белогурову Алексею Анатольевичу за научное руководство и помощь на всех этапах работы, Кудряевой Анне Анатольевне за терпение и искреннюю помощь в выполнении практической части настоящего исследования.

1. Обзор литературы по теме протеасомо-опосредованный гидролиз белков методы его мониторинга

1.1 Протеасома

Протеасома – высокомолекулярный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью. 20S протеасома в качестве протеолитического ядра входит в состав 26S протеасомы. Основной задачей протеасомы является расщепление отслуживших и дефектных клеточных белков. Есть несколько путей деградации белков протеасомой, но самым распространенным и высококонсервативным является АTP-зависимый путь с участием белка убиквитина (Ub), длиной 76 аминокислотных остатков. Около 90% короткоживущих и 70% долгоживущих белков разрушаются 26S протеасомой по убиквитин-зависимому пути. Для протеасомы основным сигналом для разрушения белка является полиубиквитиновая цепь связанная с субстратом. Маркировку белков осуществляет сложная система ферментов, называемая системой убиквитинилирования. Тем не менее, есть источники показывающие, что убиквитин-независимая деградация белков также возможна. При этом маркером для деградации может служить аминокислотная последовательность внутри самого белка, либо некая вспомогательная молекула. Протеасомы есть в клетках всех живых организмов, от архебактерий до высших эукариот, что свидетельствует об их огромной значимости для нормального функционирования клетки [1].

1.1.1 Строение и функции протеасомы

Протеасома - мультисубъединичный ферментный комплекс, осуществляющий расщепление белков в клетке [2]. 26S-протеосома состоит из надмолекулярных комплексов двух типов: центральной частицы в форме бочонка 20S и регуляторной частицы 19S на обоих ее концах (Рис. 1)[3]. 20S- протеасома представляет собой цилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм, состоящий из четырех сложенных в стопку гептамерных колец, структура протеосомы была выяснена с помощью рентгеноструктурного анализа [4]. Внешние кольца цилиндра состоят из семи гомологичных субъединиц α-типа, а каждое из внутренних колец – из семи похожих консервативных субъединиц β- типа. Масса каждой субъединицы колец составляет около 20-35 кДа. Просвет образованный кольцами делится на три полости [5]. Центральная протеолитическая полость сформирована двумя β-кольцами и отделена от двух внешних полостей, сформированными другими сторонами β-колец и α- кольцами [6]. Каталитические центры расположены на N-концах β-субъединиц, лежащих во внутренней полости цилиндра[7]. β-субъединицы (β1, β2 и β5) ответственны за каталитическую активность, на каждой из них локализовано по одному каталитическому центру, а N-концевые остатки треонина этих субъединиц действуют как нуклеофилы [8].

Рис. 1 Схема строения и сборки 26S протеосомы

Механизм катализа был установлен методами рентгеноструктурного анализа, а каталитически важный остаток – методом мутагенеза [9]. В ходе реакции протон гидроксильной группы треонина переносится на аминогруппу этой же аминокислоты, а молекула воды в активном центре действует как основание. По подобному механизму работают еще три других фермента: пенициллинацилаза (в активном центре N-концевой серин), глутамин- амидотрансфераза (в активном центре N-концевой цистеин), аспартилглюкозаминидаза (в активном центре N-концевой треонин). В эукариотической протеасоме 4 из 7 β-субъединиц содержат N-концевой треонин. Существуют предположения, что аминокислотные остатки Lys33 и Glu17 также находятся в активном центре и участвуют в катализе. Функции остальных β-субъединиц неизвестна. Структура протеосомы поддерживается α-субъединицами, хотя они и не имеют каталитической активности. Важность роли взаимодействий между субъединицами можно доказать тем что при распаде протеосомы на субъединицы каталитическая активность утрачивается полностью.

Один из активных центров протеасомы катализирует протеолиз со специфичностью по типу трипсина (расщепление полипептидной цепи после положительно заряженных аминокислотных остатков), другой – по типу химотрипсина (после ароматических аминокислотных остатков), третий – по типу каспазы (после отрицательно заряженных аминокислотных остатков). Дополнительная активность протеасомы способная расщеплять полипептидную цепь практически между любыми аминокислотными остатками сильно зависит от того, какие именно аминокислоты находятся по обе стороны от сайта расщепления.

В норме 20S протеасома существует в неактивном состоянии, так как α- субъединицы за счет своих N-концевых гидрофобных участков блокируют вход в центральный канал, препятствуя случайному протеолизу. Изменение параметров центрального канала при взаимодействии α-субъединиц с 19S регуляторным комплексом и активатором PA28, приводит к активации 20S протеасомы. Ос

Похожие работы

1 2 3 4 5 > >>